Лаборатория

Процесс свертывания крови строго контролируется присутствующими в плазме и активируемыми в ходе свертывания белками-ингибиторами, которые ограничивают выраженность протеолитических реакций и обеспечивают защиту от нежелательного тромбообразования [1, 2, 3].

Главными ингибиторами факторов свертывания крови являются серпины: антитромбин III (AT III), гепариновый кофактор II (ГК II), С1-ингибитор; ингибитор пути тканевого фактора типа Кюница; O2-макроглобулин и система протеина С.

Основную часть ингибиторной (антикоагулянтной) активности плазмы определяет АТ III [1, 3, 4], который в разной степени ингибирует почти все ферменты коагуляционного каскада: тромбин, фIXa, фXa, фXIa и фXIIа. Свободные тромбин и фXa являются основными мишенями АТ III. AT III нейтрализует сериновые протеазы посредством ковалентного связывания. В результате формируется неактивный 1:1 стехиометрический комплекс между ферментом и ингибитором путем образования связи аргининсодержащего активного центра AT III и активного серинового центра протеазы. При этом фермент утрачивает способность расщеплять любые субстраты, т. к. АТ III закрывает доступ для субстратов к активному центру фермента.

Ингибирующая способность АТ III значительно усиливается в присутствии гепарина, т. к. после взаимодействия с гепарином в молекуле АТ III в результате конформационных изменений реакционный центр экспонируется из основной структуры белка, при этом скорость ингибирования соответствующего фермента может возрастать в 1000–3000 раз [2, 5].

Дефицит АТ III значительно увеличивает вероятность развития тромбоза. Он может быть наследственным или приобретенным. Недостаток АТ III часто появляется при заболеваниях печени, ДВС-синдроме, сепсисе, тромбоэмболии легочной артерии, нефротическом синдроме, инсульте, тромбозе глубоких вен [1].

Поскольку АТ III является основным естественным ингибитором системы гемостаза и его количественная или функциональная недостаточность часто приводит к развитию тромбозов, задача мониторинга и контроля функциональной активности данного белка представляется крайне важной. Большинство методов, которые используют клинико-диагностические лаборатории в своей практике для определения активности АТ III, основаны на его способности инактивировать тромбин в присутствии гепарина. В этих методах уровень функционального AT III определяется с помощью хромогенного субстрата. Хромогенный метод, основан на том, что протеаза, остающаяся после нейтрализации АТ III, отщепляет хромофор, p-нитроаналин, от субстрата, который затем может быть измерен спектрофотометрически [10]. Метод является чувствительным, точным, и легко воспроизводимым в условиях рутинных клинических коагулогических исследований. Данный метод включает следующие этапы:

Относительно недавно было доказано, что метод определения активности АТ III, основанный на способности плазмы инактивировать фактор Ха в присутствии гепарина является более точным, специфичным и стабильным, по сравнению с традиционным методом, в основе которого лежит его способность инактивировать тромбин. Методически этот метод отличается от традиционного внесением в разведенную плазму вместо тромбина фактора Х. В результате удается исключить интерференционное влияние ГК II, который является специфичным ингибитором тромбина, на реальную активность АТ III в исследуемой плазме [6, 7, 9]. Вклад ГК II в процесс ингибирования тромбина может быть у ряда пациентов весьма существенным, поскольку скорость ингибирования данным кофактором сравнима со скоростью ингибирования протеазы АТ III [5]. Это влияние ГК II полностью отсут ствует при использовании фактора Ха вместо тромбина.

В связи с этим, определение активности АТ III методом, основанным на измерении остаточной активности фХа (АТ III-фХа), является более точным и достоверно способен выявлять дефицит АТ III у пациентов по сравнению с аналогичным методом, основанным на измерении остаточной активности тромбина (АТ III-фIIа). Данный факт подтверждается целым рядом исследований [6, 7, 9]. В работе С. Demers и соавт. (1993) проведен сравнительный анализ результатов определения активности AT-III традиционным методом по измерению остаточной активности тромбина и методом измерения остаточной активности фХа. Обследована группы пациентов (всего 67 человек) с врожденным дефицитом AT III. Контроль наличия или отсутствия дефицита AT-III осуществлялся методом ДНК диагностики. Показано, что у 16% пациентов врожденный дефицит AT III методом AT III-фIIa не был выявлен, в то время как при использовании метода AT III-фXa дефицит AT III диагностирован у всех обследуемых.

Полученные результаты показывают, что метод AT III-фIIa может «пропускать» пациентов с реальным дефицитом AT III, т. е. давать ложно положительные результаты. 

В другом исследовании [8] авторы уделили большое внимание изучению именно данного вопроса – вопроса ложно положительных результатов метода AT III-aIIa. Была исследована активность АТ III в 27 образцах плазмы пациентов с приобретенным дефицитом АТ III с лепирудином (рекомбинантный гирудин – прямой ингибитор тромбина), в АТ III – дефицитной плазме и в смеси АТ III – дефицитной плазмы с нормальной плазмой. Также активность АТ III была определена в образцах плазмы здоровых доноров, пациентов с врожденным и приобретенным дефицитом АТ III и пациентов, находящихся на гепариновой терапии. Было показано, что при конечной концентрации терапевтического значения лепирудина, активность АТ III была заметно завышена при измерении методом с AT III-фIIa, по сравнению с использованием фХа. Остаточная 39 активность АТ III в дефицитной по АТ III плазме, определенная методом, основанным на тромбине, была существенно выше в сравнении со значением, полученным с фХа. АТ III-фIIa – метод также дал завышенные результаты и в образцах пациентов, находящих на гепариновой терапии. На основе полученных данных авторы работы делают вывод, что функционально активный АТ III наиболее достоверно может измеряться хромогенным методом с использованием фХа во всех вариантах исследований. «Тромбиновый» метод также не может использоваться для пациентов, получающих терапию гирудином или другим прямым ингибитором тромбина.

Завышение значений активности АТ III у пациентов, находящихся на гепариновой терапии при измерении методом с использованием тромбина подтверждают и данные авторов другой работы, в которой подробно рассматривался вопрос о выявлении возможных причин подобного завышения [7]. Был проведен детальный клиникобиохимический анализ возможностей методов определения АТ II, основанных на тромбине и фХа. Для 460 образцов пациентов, не получающих гепариновой терапии совпадение результатов было достаточно хорошим, однако «тромбиновый» метод все же давал слегка завышенные результаты до 3% активности АТ III. Несоответствие, однако, оказалось существенным в плазмах пациентов, уровень гепарина в которых составлял 0,8–1,2 ед./мл. Анализы 102 пациентов показали, что АТ III-фIIa метод, в среднем, на 7–16% завышает реальные значения активности АТ III по сравнению с методом АТ III-фХа. Иммунологические исследования (добавление антител к АТ III и ГК II) показали, что эти различия целиком связаны с вкладом активности ГК II в «тромбиновом» методе. Результаты исследования показывают, что данные, полученные методом с использованием фХа более объективно отражают активность АТ III у пациентов, получавших лечение гепарином. Аналогичные исследования проводились японскими исследователями, где изучался эффект ГК II на активность АТ III, измеренную «тромбиновым» методом и методом с использованием фХа на плазме беременных женщин [9]. Активность плазменного АТ III беременных женщин на поздних сроках была значительно выше, чем у небеременных контрольных доноров при использовании метода с тромбином, по сравнению с использованием фХа. Эти результаты показывают, что активность AT III, измеренная «тромбиновым» методом, была завышена у беременных женщин, благодаря перекрестной активности ГК II. Авторами рекомендовано измерение активности AT III методом с использованием фXa.

Таким образом, данные многих исследователей показывают, что использование наборов реактивов для определения активности АТ III, основанных на инактивации тромбина в присутствии гепарина приводит к получению лабораторией ложно завышенных значений данного показателя, особенно выражено это будет у пациентов получающих гирудин или любые другие прямые ингибиторы тромбина. Все это может привести к по лучению врачами-клиницистами необъективных результатов определения активности АТ III и выбору неправильной тактики лечения пациентов. АТ III – гликопротеин, наиболее важный естественный ингибитор свертывания крови; ингибирует тромбин и ряд активированных факторов свертывания (Ха, XIIа, IХа). Он образует с гепарином быстродействующий комплекс – гепарин–АТ III. Снижение уровня АТ III, являющееся фактором тромбогенного риска (снижение уровня АТ III до 50–60% ведет к значительному учащению тромбозов). Низкое содержание АТ III ведет к неэффективности терапии гепарином. Ослабление действия гепарина наблюдается при снижении содержания АТ III до 50%, при снижении до 20% действие гепарина почти полностью отсутствует. В связи с этим получение ложно повышенных значений активности АТ III при использовании «тромбинового» метода может представлять существенныйриск для пациента. Использование же метода с ингибированием фХа позволяет получать надежные и точные результаты. Врачу клинической лабораторной диагностики необходимо использовать данную информацию при выборе наборов реактивов для определения активности АТ III в своей повседневной практике.

ЛИТЕРАТУРА

1. Балуда В.П., Балуда М.В., Деянов И.И., Тлепшуков И.Л. Физиология системы гемостаза / Под ред. проф. В.П. Балуды. М., 1995.

2. Карвальхо А.К.А. Гемостаз и тромбоз. В кн. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови. М.: Binom Publishers, 2000. 3. Friedberg R.C., Hagen P.O., Pizzo S.V. The role of endothelium in factor Xa regulation:

the effect of plasma proteinase inhibitors and hirudin // Blood. 1988 May; 71(5): 1321–1328.

4. Ена Я.М., Платонова Т.Н., Сушко Е.А., Шевчук Т.В. Антитромбин III: функциональная характеристика и клиническое значение // Биохимия. 1993; 9: 18.

5. Панченко Е.П., Добровольский А.Б. Тромбозы в кардиологии. М., 1999.

6. Demers C., Henderson P., Blajchman M.A., Wells M.J., Mitchell L., Johnston M., Ofosu F.A., Fernandez-Rachubinski F., Andrew M., Hirsh J. et al. An antithrombin III assay based on factor Xa inhibition provides  more reliable test to identify congenital antithrombin III defi ciency than an assay based on thrombin inhibition // Thromb. Haemost. 1993 Mar 1; 69(3): 231–235.

7. Bohner J., von Pape K.W., Blaurock M. Thrombin-based antithrombin assays show overestimation of antithrombin III activity in patients on heparin therapy due to heparin cofactor II infl uence // Thromb. Haemost. 1994 Mar; 71(3): 280–283.

8. Beeck H., Nagel D., Pindur G., Scharrer I., Preiss A., Seiler D., Hellstern P. Measurement of antithrombin activity by thrombinbased and by factor Xa-based chromogenic  substrate assays // Blood Coagul Fibrinolysis. 2000 Mar; 11 (2): 127–135.

9. Akai Y., Shiga S., Tohyama K., Shimatsu A., Ichiyama S. Effect of heparin cofactor II on the antithrombin III activities measured by thrombin methods or factor Xa methods – fundamental studies and clinical studies using the plasma of pregnant women // Rinsho Byori. 2000 Sep; 48 (9): 867–871.

10. Goodnight S.H. Jr., Schaeffer J.L., Sheth K. Measurement of antithrombin III in normal and pathologic states using chromogenic substrate S-2238. Comparison with immunoelectrophoretic and factor Xa inhibition assays // Am. J. Clin. Pathol. 1980

May; 73 (5): 639–647.