Разработка и оценка полуавтоматизированного высокочувствительного количественного определения модифицированного рапамицина биолимус А9 в крови человека с использованием жидкостной хроматографии/ тандемной масс-спектрометрии
Перевод Мазин П. В.
Ранее на нашем сайте мы рассказывали о некоторых инновационных подходах в клинической биохимии, о протеомно-метаболомном анализе биологических жидкостей и материалов. В частности, обсуждались bottom-up («восходящие») методики, методологической основой которых является жидкостная хроматография и тандемная масс-спектрометрия с помощью ионной ловушки/ спрей-ионизации (LCMS). Данные технологии не только находят все большее применение в лабораторной диагностике различных заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых. Предпринимаются успешные попытки использовать жидкостную хроматографию и тандемную масс-спектрометрию для контроля результативности интервенционного лечения, а так же для прогнозирования отсроченных осложнений после тех или иных вмешательств.
Стенты с лекарственным покрытием (Drug-eluting stents, DES) все более широко используются для лечения заболеваний коронарных артерий. Имплантация таких стентов обладает признаками самого прогрессивного интервенционного метода современности для коррекции ишемической болезни сердца (ИБС), однако и для него есть свои ограничения и специфические осложнения. Действующее вещество высвобождается из покрытия стента в течение недель/ месяцев, и важно контролировать концентрации фармагента в крови по мере этого высвобождения, продолжать исследовать фармакокинетику и фармакодинамику лекарственной субстанции даже в IV фазе клинического внедрения.
Ученые из Центра анестезиологии Денверского Университета (Колорадо, США) совместно с Калифорнийским отделением Biosensors International апробировали методику полуавтоматической квантификации соединения Biolimus A9 (C55H87NO14, молекулярный вес 986.29 Da) в человеческой крови с помощью LCMS. Приложение оказалось результативным как при начальных оценках концентраций биолимуса после внутривенных инъекций, так и при длительном мониторинге содержания этого вещества после установки соответствующего DES.
Отличительной особенностью нового метода является высокая степень автоматизации: единственным «ручным» этапом было добавление раствора для преципитации протеинов (сульфат цинка с метанолом) в образец с обработкой в вортексе (5 мин.) и центрифугированием (4°C, 13000 g, 10 мин.), после чего проводили инжекцию и экстракцию в режиме online.
Конфигурация использованного оборудования:
- жидкостный хроматограф с масс-спектрометром и системой online-экстракции, с двумя бинарными помпами, двумя вакуумными дегазаторами, термостатируемым аутосэмплером и термостатируемыми колонками в комбинации с аутосэмплером и интегрированным 6-разъемным клапаном Rheodyne.
- Трехфазный квадрупольный масс-спектрометр в качестве детектлора, программный пакет Analyst.
Операционные характеристики процесса: рабочий диапазон - 0.01 - 100 ng/mL (r2>0.99); без ионной супрессии и матрикс-интерференции; стабильность экстрагированных образцов в аутосемплере не менее 24 часов при температуре +4°C и трех циклах заморозки/ разморозки; минимальный уровень детекции биолимуса - 333 fg/mL; минимальный уровень оценки концентрации биолимуса - 10 pg/mL. Достигнута существенная чувствительность и точность теста для поставленной задачи.
Ионная хроматограмма образца крови в рамках клинического исследования. 45 минут после установки стента с биолимусом А9. Концентрация лекарственного в-ва в крови - 0,12 нг/ мл. Ось ординат - интенсивность (замеры в секунду).
Источник: C. Clavijo, T. Strom, V. Moll, R Betts et al. Development and Validation of A Semi-Automated Assay for the Highly Sensitive Quantification of Biolimus A9 in Human Whole Blood Using High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2009, November 1, 877(29), p. 3506-3514
